近年来，细胞与基因治疗产业发展如火如荼，给越来越多的患者带去了生命的希望。目前临床试验中有超过1000种基因疗法和基因修饰细胞疗法，这对传递遗传物质所需的病毒载体的需求预计将增加100到1000倍。虽然几乎所有的供应链企业都在计划扩大产能，但也将不足以满足急剧增加的需求。在产能扩张之外，我们还迫切需要提高瞬时转染过程中的效率，以提高生产率并降低成本。

瞬时转染&稳定转染

转染涉及将外来DNA/RNA引入真核细胞以修改其基因组，从而使某些蛋白质表达。当外源核酸整合到宿主核基因组中，并产生长期转基因表达结果时，即使在细胞分裂后，转染也被认为是稳定的。如果外来质粒或寡核苷酸未整合，则会发生瞬时或短期转基因表达。前者通常是冗长的遗传研究的首选，而后者已被广泛用于蛋白质表达，包括病毒载体的生产。

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转染主要分为两种方式，瞬时转染和稳定转染。稳定转染是将外源基因整合到细胞的染色体上，成为细胞基因组的一部分从而得以长期复制表达。稳定转染细胞的子代细胞也同样表达外源基因，由此形成稳定转染的细胞系。而瞬时转染的细胞中，外源基因但并不会整合到细胞的染色体上，其表达时间有限，通常仅持续几天，并且不会转移至其他新的分裂细胞中，最终实现短暂的高水平表达。

对于病毒载体生产，包括在CGT领域最常用的腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV）载体，瞬时转染通常是首选方法，因为它既灵活也足够稳定。首先，HEK293细胞系已广泛应用于制药业，改变感兴趣的基因（GOI）相对容易。对于AAV，瞬时转染还可以实现从一种血清型到另一种血清型的快速转换。另外，瞬时转染过程的持续时间较短，还允许更快的优化过程和更快地获得用于评估治疗潜力的产品。此外，瞬时转染能够快速制造足够数量的病毒载体，以支持临床开发和商业制造。

瞬时转染的替代方法包括使用杆状病毒表达载体系统（BEVS）和/或单纯疱疹病毒细胞感染草地贪夜蛾（Sf9）昆虫细胞，但这些方法存在一些问题，包括开发时间长、AAV血清型适用性有限以及质量问题。科研人员长期努力的重点就是开发稳定的包装/生产细胞系，这些细胞系可提供高病毒滴度，同时避免细胞毒性。这种方法的一个挑战是需要预先投入大量时间和金钱，鉴于基因和基因修饰细胞疗法的开发时间很短，这可能很困难。

大规模高效载体生产亟待提高

当今市场上为数不多的基因疗法是为罕见病而开发的，通常涉及对小区域（例如眼睛）进行局部给药。预计在未来几年内获得批准的基因和基因修饰细胞疗法的数量可能会超过50种，其中大部分将利用病毒载体作为递送工具。随着技术的发展，未来或许可能会有更多的疗法面向常见病，而且给药方式可能会从局部给药变成全身给药；另一方面，基因治疗的潜力足以成为一线疗法而不是最后的希望，因此，更大剂量更低毒性才是未来的主流需求。

目前基因治疗开发商、设备制造商和原材料供应商之间已经进行了重要的合作，以开发具有成本效益的、可平台化的解决方案，以实现病毒载体生产的瞬时转染工艺的工业化。例如现在可实现在生物反应器中扩展瞬时转染过程，用于悬浮和贴壁细胞培养。通过实验设计（DoE）研究进行工艺开发可以优化多个工艺参数，并带来更好的性能。专门为生产病毒载体而设计的定制质粒和适合用途的转染试剂也能提高功能载体的产量。

挑战一：优化时间短

开发具有成本效益、可扩展的病毒载体制造工艺的主要挑战之一是分配给工艺优化的时间非常短。获得单克隆抗体产品的监管批准通常需要10年；对于细胞和基因疗法，这个时间减少了一半以上，仅为3-4年。

因此，通常会在商品成本和可扩展性方面做出妥协。使这个问题复杂化的是多步瞬时转染过程的复杂性。基因疗法的生物制剂许可申请可能长达数万页，其中大部分与制造数据相关，监管机构审查时间的大部分时间都集中在制造和质量问题上。其他因素包括缺乏简单的平台化，以及在早期开发阶段依赖在塑料器皿中进行的小规模贴壁细胞培养过程，并且需要大量人工干预——这种方法实际上无法工业化。

挑战二：很难突破的转染效率

其他挑战与瞬时转染的性质有关，瞬时转染本质上在更大规模时效率会降低。对于AAV载体，随着血清型和转基因的变化，功能性病毒颗粒的产量也有显着变化。还缺乏通过商业化GMP生产支持工艺开发的快速、灵敏和稳健的分析技术，包括比较使用不同工艺生产的载体和产品放行。

必须投入时间来了解病毒载体产品的具体要求，以便开发合适的、稳健的细胞系。还需要一种质量源于设计的工艺开发方法，以便能够确定最佳工艺参数，例如，转染时的细胞密度、培养基和补充剂的选择、试剂与DNA的比率、质粒比率、总DNA用量、转染试剂的选择、复合条件和时间、复合混合物的添加速率、转染时间等。

DNA质粒必须正确测序且不含杂质，最好使用下一代测序技术来确认质量和纯度。必须选择能够在所有规模上提供高滴度功能载体的转染试剂，同时最大限度地减少原材料需求和处理量。制造过程还应该足够灵活，以响应需求的变化。总的来说，最好的策略是采用一次成功的方法来开发瞬时转染工艺，以提供高质量的产品，并且在cGMP条件下可扩展且实用。

优化转染效率的方向

悬浮和贴壁细胞培养解决方案

为了克服在塑料器皿中使用贴壁细胞培养进行瞬时转染的局限性，人们采用了两种不同的策略。已经开发出固定床生物反应器，允许缩放-至少在某种程度上-粘附过程。另外，对HEK293细胞进行了修改，以支持传统搅拌罐生物反应器中的悬浮细胞培养。

基于悬浮液的瞬时转染很有吸引力，因为它避免了将细胞从使用的任何类型的支持物上分离的需要。它还支持使用现有设备，包括传感器和自动化技术。虽然固定床生物反应器也是如此，但生物反应器技术专为粘附过程而设计。因此，这两种方法都减少了可变性并简化了工艺开发。

然而，市面上可用于基于悬浮液的瞬时转染的修饰细胞系数量有限，而高性能的专有细胞系可能需要长达一年的时间才能开发出来。此外，已知HEK293衍生细胞会在通常与悬浮细胞培养相关的较高细胞密度下聚集。

在一个例子中，转基因、包装和辅助质粒的比例、总DNA浓度和细胞密度同时变化，揭示了一种意想不到的工艺参数组合，可显着提高功能性病毒基因组的产量。人们越来越认识到，在早期开发期间使用缩小模型实施有针对性的DoE方法可以显着提高工艺效率和生产率，从而影响产量、质量和成本。通过不仅评估影响质量的工艺参数，还评估影响可扩展性的工艺参数，可以进一步最大化此类DoE策略。

定制质粒

用作基因疗法和用于生产基因修饰细胞疗法的病毒载体是由质粒制成的，质粒是许多细菌物种中发现的小的、通常是环状的双链DNA单元。质粒质量是瞬时转染效率的关键决定因素。在选择用于病毒载体制造的质粒时，必须仔细评估质粒的某些特性，包括它们的复制起点，这决定了载体拷贝数、抗生素抗性基因等。此外，用于病毒载体生产的质粒必须主要由超螺旋DNA亚型组成。

一般来说，趋势是使用更小的质粒，不含任何不必要的遗传物质，包括抗生素抗性基因，以促进转染效率的提高。NatureTechnology声称其Nanoplasmid™DNA提供比传统质粒和小环更高水平的基因表达，以及更持久的效力。

鉴于质粒质量的至关重要性，监管机构越来越重视使用GMP级材料（而不是研究级质粒）来生产用于后期临床和商业基因治疗产品的病毒载体。然而，高质量的非GMP质粒可用于早期临床试验。因此，许多质粒制造商提供研究级、临床级和GMP级质粒，供不同开发阶段使用。

适合用途的转染试剂

对瞬时转染过程的更深入了解揭示了转染剂在决定转染效率和生产力方面的重要性。常见的第一代转染试剂包括线性聚合物聚乙烯亚胺（PEI)和基于脂质的Lipofectamine试剂，其中大部分最初并非为此目的而开发，因此无法实现最佳工艺性能。

提高效率和生产力的许多积极影响

更高产量的功能载体有助于提高效率和生产力，并最终降低成本。如果每批生产更多的载体，可以获得更多的剂量。例如，假设该过程的所有其他方面（例如，生物反应器大小、下游加工、耗材比例）保持不变，滴度增加两倍将导致在相同成本水平下生产两倍数量的剂量。因此，每剂量的成本将减半，但可以治疗两倍的患者。

或者，生产相同数量所需的批次更少，或者可以在更小的设备中生产相同数量的批次。在所有情况下，都会降低商品成本并节省时间。因此，最终的影响将是加速基因疗法的发展，并让更多的患者获得这些改变生命和挽救生命的治疗方法。（来源医麦客）返回搜狐，查看更多

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